Bài TH2 - Các kĩ thuật trong XN miễn dịch

Kỹ thuật Elisa

ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay EIA = Enzyme immunoassay

Mục đích sử dụng: định lượng kháng thể hoặc kháng nguyên có trong 1 hỗn hợp
Nguyên lý: Phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể, phát hiện bằng phản ứng enzyme – cơ chất

Các dụng cụ cần thiết:

Một số mẫu thí nghiệm thông dụng: Máu: (huyết tương, huyết thanh), Nước bọt, Nước tiểu, Tinh dịch, Dịch lọc phân, Dịch não tuỷ, Môi trường cấy tế bào

Các dạng ELISA: Direct, Indirect, Sandwich, Competitive

Indirect ELISA - Kháng Thể

Mục đích: Phát hiện kháng thể kháng với 1 kháng nguyên đặc hiệu

Các bước cơ bản:

Antigen coating: KN đặc hiệu
Primary antibody: hỗn hợp chứa kháng thể muốn tìm (VD: serum)
Secondary antibody: kháng-kháng kháng thể muốn tìm. Kháng thể này thường gắn với 1 loại enzyme (VD: conjugated anti-IgG antibody)
Substrate: Cơ chất của enzyme à màu
Stop: dung dịch làm ngưng phản ứng enzyme - cơ chất

Sandwich ELISA - Kháng Nguyên

Mục đích: Phát hiện kháng nguyên đặc hiệu

Các bước cơ bản:

Primary (capture) antibody coating: KT đặc hiệu với nguyên cần tìm
Antigen: hỗn hợp chứa kháng nguyên muốn tìm (VD: serum)
Secondary antibody: KT kháng kháng nguyên muốn tìm. KT này thường gắn với 1 loại enzyme (conjugated antibody)
Substrate: Cơ chất của enzyme à màu
Stop: dung dịch làm ngưng phản ứng enzyme - cơ chất

Định lượng

Dung dịch chuẩn (Standard): Sử dụng phương pháp pha loãng từ dung dịch có nồng độ cao nhất (serial dilution)

Đường chuẩn (Standard curve):

Từ mật độ quang học (optical density – OD) đo được và nồng độ chuẩn đã biết à phương trình tương quan (đường chuẩn)
Dựa vào OD của mẫu, áp vào phương trình tương quan, tính được nồng độ mẫu

Protocol mẫu

Coating, Incubation overnight, at 4oC
Washing
Blocking
Sample loading, Incubation
Washing
Secondary antibody, incubation
Washing
Substrate loading, incubation
Stop 10.Read the plate

Hãy mô tả các bước thí nghiệm nếu bạn muốn đo nồng độ:

Nồng độ IgE huyết thanh đặc hiệu với mạt nhà
Nồng độ CRP trong huyết thanh

Kỹ thuật Western Blot

Blotting là chuyển một đại phân lên trên 1 màng sinh học cố định:

Northern blot (RNA)
Southern blot (DNA)
Western blot (protein)

Mục đích: phát hiện protein / kháng thể (bán định lượng)
Nguyên lý: Phản ứng kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu

Dụng cụ

Polyacrylamide gel electophoresis (PAGE):

Native PAGE: bảo toàn cấu trúc protein
SDS-PAGE (thêm SDS): tạo cấu trúc bậc 1 của protein

Transfer membrane

Nitrocellulose membrane
PVDF (polyvinylidene diflouride) membrane

Các bước tiến hành

Protein denaturation: đun nóng hỗn hợp protein ở 95oC trong buffer chứa SDS
Electrophoresis: Điện di để phân tách các protein bằng SDSPAGE
Transfer: Điện di để chuyển protein từ gel sang màng
Blocking, nhuộm màng, rửa màng
Primary antibody: Ủ màng với antibody kháng protein mục tiêu
Rửa màng
Secondary antibody: Ủ màng với antibody kháng với primary antibody, 2nd antibody có gắng với enzyme
Rửa màng
Substrate: Ủ màng với substrate để có tín hiệu

ỨNG DỤNG - ĐỊNH LƯỢNG IgE ĐẶC HIỆU

Trong hạt phấn hoa hướng dương chứa rất nhiều protein khác nhau. Một sinh viên muốn xác định protein chính gây ra mẫn cảm IgE trên BN dị ứng với phấn hoa hướng dương. Bạn hãy thiết kế một protocol tóm tắt các bước mà SV trên cần phải làm.

Kỹ thuật Hoá mô MD

Nhuộm mô với anti- CCR3 antibody (marker cho eosinophil)

Nhuộm tế bào biểu mô phế nang với anti-cytokeratin 18 antibody

Các bước:

Sinh thiết / ly trích
Fixation
Blocking
Primary Ab: Nhuộm với KT kháng protein mong muốn
Secondary Ab: gắn với enzyme hoặc flourescent dye
Substrate (nếu cần)

Tóm tắt

TÓM TẮT

Các thí nghiệm ELISA, Western Blot, Hoá tế bào/mô miễn dịch đều có nguyên lý dựa trên phản ứng kháng nguyên kháng thể
Phương pháp ELISA thường sử dụng là Indirect ELISA (để phát hiện KT) và sandwich ELISA (để phát hiện KN) 3. Western Blot có thể được sử dụng để khảo sát 1 loại protein mong muốn hoặc để phát hiện KT đặc hiệu của 1 KN nào đó
Hoá tế bào/mô miễn dịch trên lâm sàng thường sử dụng để khảo sát một loại protein nào đó hoặc sự lăng đọng của các KT miễn dịch